Методы окраски ретикулоцитов

Подсчет ретикулоцитов в крови

Методы окраски ретикулоцитов

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

  1. Предметные стекла.
  2. Шлифованные предметные стекла.
  3. Влажная камера.
  4. Смесители для белых и красных кровяных телец.
  5. Стекла с луночкой.
  6. Микроскоп.
  7. Бриллианткрезиловая синька.
  8. Абсолютный этиловый спирт.
  9. Метиловый спирт или смесь Никифорова (равные части этилового 96° спирта и эфира).
  10. Реактив Гайема или 3% раствор поваренной соли.
  11. Иммерсионное масло.
  12. Набор инструментов для укола в палец.

В зависимости от строения зернисто-сетчатой субстанции различают пять видов ретикулоцитов: пылевидный, венчикообразный, неполносетчатый, полносетчатый и клубкообразный (см. рис).

Различные группы ретикулоцитов по степени зрелости

Взятие крови с целью подсчета в ней ретикулоцитов производят по указанию врача. Чтобы подсчитать количество ретикулоцитов, их окрашивают. С этой целью используют:

  1. Способ прижизненной (суправитальной) окраски ретикулоцитов.
  2. Способ одновременной суправитальной окраски тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву.

Рассмотрим данные способы более подробно.

Прижизненная (суправитальная) окраска ретикулоцитов

Для этого способа необходимы следующие реактивы:

  1. Абсолютный этиловый спирт: в сухую с притертой пробкой посуду помещают прокаленную безводную (белого цвета) сернокислую медь и приливают 1/4 часть абсолютного спирта. Содержимое взбалтывают. Абсолютный спирт (спирт, не содержащий воды) можно получить обезвоживая спирт сернокислой медью, предварительно прокаленной. Обезвоживание прекращают тогда, когда сернокислая медь перестает голубеть.
  2. Насыщенный раствор бриллианткрезиловой синьки в абсолютном спирте: к 80 мл абсолютного спирта прибавляют 1 г бриллианткрезиловой синьки.
  3. Азур I.

Техника прижизненной окраски и подсчета ретикулоцитов

Предметные стекла заранее покрывают насыщенным раствором бриллианткрезиловой синьки. Свежевыступившую каплю крови распределяют по предметному стеклу с краской, как при приготовлении мазка крови.

Препарат немедленно помещают на 6-8 минут во влажную камеру, после чего высушивают на воздухе и микроскопируют (окуляр 7Х, объектив 90X с поднятым конденсором). Ретикулоциты подсчитывают точно так же, как тромбоциты, с ограничителем поля зрения.

Ретикулоциты, окрашенные бриллианткрезиловой синькой, бледно-зеленые с сеточкой голубого или синего цвета (см. рис.).

Ретикулоциты, окрашенные бриллианткрезиловой синькой

Вместо бриллианткрезиловой синьки для окраски ре тикулоцитов можно использовать, согласно прописи Магиной, краску азур I (1 г азура I на 40 мл абсолютного спирта; выдерживают при комнатной температуре 2 дня).

Одновременная суправитальная окраска тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву

Для этого способа применяют краску Алексеева.

В колбу емкостью 100 мл насыпают 1 г краски азур II и добавляют приготовленный в отдельной колбе реактив следующего состава: 5 г лимоннокислого натрия, 4 г хлористого натрия и 45 мл дистиллированной воды.

Содержимое колбы медленно нагревают на асбестовой сетке при постоянном помешивании, не доводя до кипения. Охлаждают, фильтруют. Фильтрат используют в качестве рабочего раствора краски.

Техника одновременной окраски и подсчета тромбоцитов и ретикулоцитов

В смеситель для лейкоцитов до метки 1,0 набирают краску Алексеева, вытирают кончик от краски и кладут на стол. Производят более глубокий, чем обычно, укол в палец. Кровь набирают до 4/5 объема расширенной части смесителя, следя за тем, чтобы в нее не попадали пузырьки воздуха.

Кровь быстро выдувают из капиллярной части смесителя на ватку, а остальное содержимое — в луночку предметного стекла. С луночки жидкость вновь набирают в смеситель. Двух-, троекратным повторением этой манипуляции смешивают кровь с реактивом.

Набрав последний раз жидкость в смеситель, его оставляют в горизонтальном положении на 15-30 минут для окрашивания ретикулоцитов и тромбоцитов. Затем смеситель встряхивают в течение минуты и выпускают 1-2 капли. Из последующих капель готовят тонкие мазки.

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом и докрашивают краской Романовского в разведении 1-2 капли на 1 мл воды в течение 35-45 минут. Краску смывают водой, а мазки высушивают и микроскопируют. В мазке, окрашенном по Алексееву, ретикулоциты розовые с сеточкой синего цвета (см. рис.), а тромбоциты голубовато-сиреневого цвета.

Ретикулоциты, окрашенные по Алексееву

Подсчет ретикулоцитов и тромбоцитов производят одновременно на 1000 эритроцитов так же, как описано в теме «Тромбоциты». Результаты для ретикулоцитов выражают в promille; тромбоциты рассчитывают на 1 мм3 крови (для расчета учитывают количество эритроцитов, подсчитанных у данного больного).

В крови здоровых лиц насчитывают 5-10 % ретикулоцитов.

Источник: http://ginekolog.my1.ru/publ/klinicheskie_issledovanija/blood/podschet_retikulocitov_v_krovi/39-1-0-760

Суправитальный метод окраски ретикулоцитов

Методы окраски ретикулоцитов

Принцип:

Выявлениезернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитовпри окраске бриллиант-крезиловым синимбез предварительной фиксации.

Реактивы:

1% раствор бриллиант-крезилового синего:50 мг краски растворяют в 5 мл физиологическогораствора и добавляют 20 мг цитрата натрия(раствор хранят в посуде из темногостекла, годен в течение несколькихдней).

Методика:

Напредметное стекло с лункой наносят 2капли 1 % раствора краски бриллиантовогокрезилового синего и 1 каплю крови.Осторожно перемешивают стекляннойпалочкой и смесь помещают во влажнуюкамеру (чашку Петри, в которую по краямвкладывают слегка смоченные валикимарли или ваты) на 30 минут при комнатнойтемпературе. Затем делают мазки ивысушивают.

Подсчетретикулоцитов:

Вмазках эритроциты окрашиваются вжелтовато-зеленый цвет, а зернисто-сетчатаясубстанция в ретикулоцитах – в синий ифиолетовый цвет.

Мазкимикроскопируют с иммерсионным объективом.Подсчет ретикулоцитов производят на1000 эритроцитов (большая точностьполучается при подсчете 2000-3000 эритроцитов).

Увеличениечисла ретикулоцитов наблюдаетсяпри:

  • стимуляции эритропоэза (кровопотеря, гемолиз, ретикулоцитарный криз при успешном лечении В12-дефицитной анемии, острый недостаток кислорода).

Уменьшениечисла ретикулоцитов наблюдаетсяпри:

  • угнетении эритропоэза (апластические и гипопластические анемии, нелеченные В12-дефицитные анемии, метастазы рака в кости),
  • заболеваниях почек, эндокринных заболеваниях.

Увеличениеретикулоцитов их в периферической крови(ретикулоцитоз) отмечается:•при гемолитическиханемиях (числоретикулоцитов может доходить до 60% иболее (особенно сильно увеличиваясьпри гемолитических кризах);•при острых кровопотерях (на 3 – 5 суткипосле кровопотери возникает ретикулоцитарныйкриз), в том числе, увеличение ретикулоцитовпозволяет заподозрить скрытое кровотечение(например, у больных язвенной болезньюжелудочно-кишечного тракта, брюшнымтифом);•при малярии; •при полицитемии; •при лечении железом железодефицитныханемий (через несколько дней (3 – 10) посленачала антианемического леченияпернициозной анемии); •при остром недостатке кислорода;•при метастазах опухолей в костныймозг. Следуетпомнить,что в случае усиленного разрушенияэритроцитов доля ретикулоцитов можетпревышать 50% вследствие искусственногозавышения числа ретикулоцитов (как ужебыло отмечено ранее, доля ретикулоцитоврассчитывается в % от всех эритроцитов).В таких случаях ля оценки тяжести анемийиспользуют «ретикулярный индекс»,который рассчитывают по формуле: (%ретикулоцитов х гематокрит) / 45 х 1,85, где45 – нормальный гематокрит, 1,85- количествосуток, необходимых для поступленияновых ретикулоцитов в кровь. Если индекс< 2 – говорит о гипопролиферативномкомпоненте анемии, если > 2-3, то происходитувеличение образования эритроцитов. Истинныйретикулоцитоз:увеличение количества ретикулоцитовв периферической крови с одновременнымувеличением количества ретикулоцитовв костном мозге.  Ложныйретикулоцитоз:отсутствие повышенного количестваретикулоцитов в костном мозге приповышении их количества в периферическойкрови (что говорит об усилении вымыванияретикулоцитов из костного мозга впериферическую кровь). Фактором,приводящим к увеличению значения %-огосодержания ретикулоцитов могут бытьприем следующих препаратов: кортикотропин,противомалярийные лекарственныесредства, жаропонижающие препараты,фуразолидона (у маленьких детей),леводопы.  Запомните:ретикулоцитоз, без соответствующейэритронормобластической реакциикостного мозга, наблюдается прираздражении отдельных участков егораковыми метастазами или воспалительнымиочагами. Возможнойошибкой при подсчете ретикулоцитовможет быть их ложное завышение из-заналичия: •включений в эритроцитах (тельца Жолли,малярийные паразиты); •высокого лейкоцитоза;•аномальной формы гемоглобина;•гипертромбоцитоза;•гигантских тромбоцитов. Снижениеколичества или отсутствие ретикулоцитов(ретикулоцитопения) наблюдается:•при арегенераторных апластических игипопластических анемиях; •при анемиях, вызванных недостаточностьюсодержания железа, витамина B12, фолиевойкислоты (микроцитарно-гипохромные имегалобластные анемии); •при талассемии; •при сидеробластной анемии; •при метастазах рака в кость; •при лучевой болезни и лучевой терапии; •при лечении цитостатиками;•при аутоиммунных заболеваниях системыкроветворения; •при заболеваниях почек; •при алкоголизме; •при рецидиве анемии Аддисона-Бирмера;•при микседеме. Факторы,искажающие результат лабораторногоисследования %-ого содержанияретикулоцитов:•неправильный выбор антикоагулянта илинедостаточное перемешивание крови сантикоагулянтом;•длительное сдавливание руки жгутом; •прием сульфаниламидов (возможны какзаниженные, так и завышенные результаты); •переливание крови незадолго доисследования;•гемолиз пробы крови.  Показанияк назначению анализа на ретикулоциты: •оценка активности эритропоэза присостояниях, сопровождающихся гемолизомили кровопотерей;•ценка способности костного мозга крегенерации после цитотоксическойтерапии и трансплантации костногомозга;•ценка восстановления синтеза эритропоэтинапосле трансплантации почки;•допинговый контроль у спортсменов(прием эритропоэтина);•диагностика неэффективного гемопоэзаили снижения продукции эритроцитов;•дифференциальная диагностика анемий;•детекция нарушения регенераторнойспособности костного мозга при дефицитежелеза, витаминов B12, B6, фолатов, меди имониторинга соответствующей терапии;•оценка реакции на терапию эритропоэтином,эритросупрессорами.

МЕТОДЫПОДСЧЕТА КОЛИЧЕСТВА РЕТИКУЛОЦИТОВ

(1) Подсчетколичества ретикулоцитов в мазке послеокраски их специальными красителями.  Данныйметод является на практике наиболееиспользуемым методом в связи с тем, чтоон простой, достаточно дешевый и нетребует специального дорогостоящегооборудования, соответственно можетприменяться в любой клинико-диагностическойлаборатории.

Принципметода основан на выявлении зернисто-сетчатойсубстанции ретикулоцитов при суправитальнойокраске щелочными красками (насыщенныйраствор бриллиантового крезиловогосинего в абсолютном спирте / растворазура I /раствор азура II) с дальнейшимподсчетом их в мазке крови. Окраскуретикулоцитов проводят либо на стекле,либо в пробирке.

  Подсчетосуществляют с помощью микроскопа:приготовленные одним из указанных вышеспособов мазки микроскопируют симмерсионным объективом; в мазкеретикулоциты и эритроциты окрашены вжелтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатаясубстанция в ретикулоцитах – в синий(при окраске азуром II и бриллиантовымкрезиловым синим) или синевато-фиолетовыйцвет (при окраске азуром I).

(2) Подсчетколичества ретикулоцитов при помощилюминесцентной микроскопии.

  Данныйметод отличается простотой и требуетнемного времени, более точен по сравнениюс обычным методом, так как при люминесцентноймикроскопии обнаруживаются мельчайшиезерна сетчато-нитчатого вещества, однакоон возможен только при наличиилюминесцентного микроскопа и специальныхкрасителей, в связи с чем доступен лишьнемногим лабораториям.

Принципподсчета количества ретикулоцитов припомощи люминесцентной микроскопииоснован на использовании способностисубстанции ретикулоцитов флюоресцироватьпосле обработки крови акридиновыморанжевым. Кровь смешивают с акридиновыморанжевым в пробирке или смесителе всоотношении 1 часть крови и 10 частейкраски (смесь можно хранить не более 5часов).

Смесь перемешивают в течение 2минут, каплю смеси наносят на предметноестекло и накрывают покровным стеклом.При этом жидкость не должна выходитьза пределы покровного стекла.  Микроскопируютс помощью светофильтра ЖС-17.

В препаратеэритроциты имеют темно-зеленые очертанияи не флюоресцируют, а в ретикулоцитахзернисто-сетчатая субстанция светитсяярко-красным цветом, благодаря чемуретикулоциты легко подсчитать. В крови,стабилизированной гепарином или цитратомнатрия, флюоресценции ретикулоцитовне наблюдается.

(3) Автоматическийподсчет количества ретикулоцитов спомощью гематологического анализатора. Всовременных гематологических анализаторахтехнология подсчета форменных элементовкрови основана на кондуктометрическомметоде, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culterв 1947 г.

Принцип метода заключается вподсчете числа и определении характераимпульсов, возникающих при прохожденииклетки через отверстие малого диаметра(апертуру), по обе стороны которогорасположены два изолированных друг отдруга электрода. Каждое прохождениеклетки через апертуру сопровождаетсяпоявлением электрического импульса,который регистрируется электроннымдатчиком.

Разделение клеток по категориям(эритроциты, лейкоциты, тромбоциты,осадок) осуществляется прибором наосновании анализа амплитуды полученныхимпульсов.Чтобы определить концентрациюклеток, достаточно пропустить определенныйобъем пробы через канал и подсчитатьколичество импульсов, которые при этомгенерируются.

  Следуетобратить внимание на то, что помимоклассического параметра ретикулоцитов- относительное (%) содержание ретикулоцитов(RET%, percent of reticulocytes), определяемого спомощью 1 и 2 методов лабораторнойдиагностики, в связи с появлениемвысокотехнологичных гематологическиханализаторов (3 метод) стало возможнымполучать (например, с помощьюзапатентованного флюоресцентногокрасителя для анализатора Sysmex -XT- 2000i)дополнительные информативныеретикулоцитарные параметры:• ретикулоцитыс низким содержанием РНК, наиболеезрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракцияретикулоцитов с низкойфлуоресценцией);• ретикулоцитысо средним содержанием РНК (MFR%,medium fluorescence reticulocyte fractions) – фракцияретикулоцитов со среднейфлуоресценцией);• ретикулоцитыс высоким содержанием РНК (HFR%,high fluorescence reticulocyte fractions) – фракцияретикулоцитов с высокойфлуоресценцией);• незрелаяфракция ретикулоцитов (IRF%,Immature Reticulocyte Fraction). Дифференцировкаретикулоцитов, основанная на степенизрелости и, соответственно, содержаниинуклеиновых кислот, является отражениемгемопоэтической активности костногомозга. Методика(анализатор Sysmex -XT- 2000i). В проточнойкювете клетки пересекают лучполупроводникового лазера, при этомпроисходит рассеивание луча под большими малым углами и возбуждение флюоресцентногокрасителя. Это позволяет определятьразличные стадии зрелости ретикулоцитовпо содержанию РНК в клетках и интенсивностиих свечения. Автоматизированный подсчетретикулоцитов отличается высокойточностью (подсчитывается более 30 000эритроцитов) и воспроизводимостью(коэффициент вариации составляет около6%). Данная технология обеспечиваетточный подсчет ретикулоцитов даже приих предельно низких концентрациях. 

  1. Ретикулоцитопении и ретикулоцитозы, причины развития, диагностическое значение их выявления.

Источник: https://studfile.net/preview/5844876/page:15/

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями

Методы окраски ретикулоцитов

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями является на практике наиболее используемым методом подсчета количества ретикулоцитов. Это связано с тем, что метод простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, в связи с чем может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

см. также статьи Ретикулоциты и Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии

Принцип метода

Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.

Можно использовать один из следующих красителей:

  1. Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски.
  2. Раствор азура I: азур I – 1 г, аммония оксалат – 0,4 г, натрия хлорид – 0,8 г, этиловый спирт 96% – 10 мл, дистиллированная вода – 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2 – 3 дня в термостат при 37° C и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.
  3. Раствор азура II: азур II – 1 г, натрия цитрат – 5 г, натрия хлорид – 0,4 г, дистиллированная вода – 45 мл. Раствор оставляют в термостат при 37° C на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15 – 20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Микроскоп.

Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

При окраске ретикулоцитов на стекле хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из перечисленных выше красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Стеклографом маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски.

В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Перед проведением анализа готовят влажную камеру. Обычно для этого пользуются чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или фильтровальной бумаги. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3 – 10 мин.

Затем высушивают мазки на воздухе.

Окраска ретикулоцитов в пробирке отличается при использовании разных красителей.

Метод 1 – окраска ретикулоцитов в пробирке бриллиантовым крезиловым синим

Перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски бриллиантового крезилового синего. В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 минут. Затем снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2 – окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II

В пробирку помещают 0,05 мл раствора краски азур II и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20 – 30 минут. Снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 3 – окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I

В пробирку помещают 0,3 – 0,5 мл раствора краски азур I и 5 – 6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1 – 1,5 часа (ретикулоциты окрашиваются лучше при экспозиции 1,5 – 3 часа). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

В настоящее время в продаже имеются готовые красители для ретикулоцитов заводского изготовления. Окраска ретикулоцитов с их помощью производится согласно прилагаемой инструкции.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. В мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

Фотографии ретикулоцитов:

Окраска ретикулоцитов
Ретикулоциты
Ретикулоциты
Ретикулоциты
Reticulocytes

Находят поля зрения, где эритроциты располагаются раздельно. В этих полях зрения необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. Большая точность получается при подсчете на 2000 – 3000 эритроцитов.

В связи с тем, что в поле зрения располагается большое количество эритроцитов, что затрудняет подсчет, необходимо ограничить (уменьшить) поле зрения.

Для этого можно воспользоваться либо специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров, либо воспользоваться специальным «окошком» (из бумаги вырезают круг диаметром несколько меньше окуляра, в центре круга вырезают небольшой ромбик и вставляют полученное окошко в окуляр).

Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 100 (в процентах) или на 1000 (в промилле) эритроцитов.

Пример: При подсчете в мазке 1000 эритроцитов выявлено, что 15 эритроцитов из 1000 имеют зернисто-сетчатую субстанцию той или иной степени, то есть являются ретикулоцитами. Следовательно, количество ретикулоцитов в данном случае составляет 1,5% или 15‰.

Клиническое значение определения количества ретикулоцитов.

  • Справочник “Лабораторные методы исследования в клинике” под редакцией Меньшикова В. В. – Москва, “Медицина”, 1987 г
  • Любина А. Я., Ильичева Л. П. и соавторы – “Клинические лабораторные исследования” – Москва, “Медицина”, 1984 г.

Метод подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества.

Раздел: Гемоцитология

Читать

Ретикулоциты – молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции (ретикулума), представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.

Раздел: Гемоцитология

Читать

Тельца Жолли (тельца Хауэлла-Жолли) – мелкие круглые фиолетово-красные включения размером 1 – 2 мкм, встречаются по 1 (реже по 2 – 3) в одном эритроците. Предсталяют собой остаток ядра после удаления его РЭС. Выявляются при интенсивном гемолизе и “прегрузке” РЭС, после спленэктомии, при мегалобластной анемии..

Раздел: Гемоцитология

Читать

Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).

Раздел: Цитохимия

Читать

Метод Нечипоренко в отечественной лабораторной диагностике является наиболее распространенным методом количественного определения форменных элементов в моче.

Этот метод наиболее прост, доступен любой лаборатории и удобен в амбулаторной практике, а также имеет ряд преимуществ перед другими известными количественными методами исследования осадка мочи.

По методу Нечипоренко определяют количество форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов и цилиндров) в 1 мл мочи.

Раздел: Анализ мочи

Читать

Источник: http://www.clinlab.info/Hemocytology/Reticulocytes-counting-49

Проект

Методы окраски ретикулоцитов

Вид работы: Проект

Тема: Лабораторные методы исследования ретикулоцитов

ВВЕДЕНИЕ

Ретикулоциты — молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции (ретикулума), представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.

Актуальность темы заключается в том, что ретикулоциты обитают как в периферической крови — так и костном мозге. Их доля повышается при ускорении эритропоэза, а при замедлении — снижается.

У новорожденных ретикулоцитов больше, чем у взрослого человека. Количество их прямо пропорционально скорости производства эритроцитов в костном мозге. Подсчет производится для оценки активности эритропоэза.

Объект исследования – методы исследования и подсчета ретикулоцитов.

Предмет исследования – разнообразие лабораторных методов исследования и подсчета ретикулоцитов.

Цель исследования: изучить разнообразные лабораторные методы исследования ретикулоцитов.

Задачи исследования:

  1. Обозначить методы исследования и подсчета ретикулоцитов;
  2. Изучить особенности окраски и подсчета ретикулоцитов;
  3. Приобрести практические навыки проведения общего клинического анализа крови.

В качестве методов исследования в курсовой работе были использованы: обзорный, статистический, аналитический и систематический методы.

Характеристика ретикулоцитов

Ретикулоциты — это молодые формы эритроцитов, образовавшиеся из нормобластов после потери ими ядра (безъядерные, незрелые эритроциты), созревание которых происходит в течение 24-48 ч после выхода в периферическую кровь из костного мозга, и отражающие регенеративную способность костного мозга (т.е. эритропоэтическую активность костного мозга).

В нормальных условиях часть полихроматофильных нормоцитов теряют ядро, превращаясь в ретикулоцит. Он является незрелым эритроцитом.

В нем определяется сетчатая субстанция, которая является артефактом и состоит из агрегированных митохондрий, комплекса Гольджи, рибосом и других органелл, которая при прижизненной окраске (бриллиантовым крезиловым синим, акридиновым оранжевым) выявляется в виде сетчатой субстанции. В мазках, окрашенных обычным способом, сетчатая субстанция не видна, и эритроциты имеют полихроматофильную окраску.

Образовавшийся в КМ ретикулоцит пребывает в нем 36-44 часа, а затем попадает в кровь, где дозревает в течение 24-30 часов.

В период пребывания ретикулоцитов в КМ в них происходит синтез большого количества белковых фракций, входящих в состав мембран, синтез липидов и гема.

Костномозговые ретикулоциты, каково бы ни было их абсолютное количество, образуют небольшой резерв красной крови. По ретикулоцитозу судят об эффективности эритропоэза. ретикулоцитов в норме 0,8-1,3, до 0,2-2 %.

Весь цикл развития от эритробласта до ретикулоцита составляет от 3-4 до 5-7 дне​й.

Ретикулоциты обычно крупнее, чем зрелые эритроциты. Цитоплазма ретикулоцитов содержит базофильную сеточку (ретикулум) в виде мелких зерен, отдельных нитей, клубочков и т.п., которая представляет собой агрегированные рибосомы и митохондрии [2].

По степени зрелости различают 5 видов ретикулоцитов:

1) ретикулоциты, имеющие ядро (эритронормобласты), причем зернистость у них располагается в виде плотного венчика вокруг ядра;

2) ретикулоциты, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде клубка или глыбки;

3) ретикулоциты, имеющие зернистость в виде густой сети;

4) ретикулоцитов, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде отдельных нитей;

5) ретикулоциты, содержащие отдельные зернышки.

Следует запомнить: в норме, по Г. А. Алексееву, почти 80% ретикулоцитов относится к IV – V группам.

В норме в периферической крови содержится 0,2 – 1% ретикулоцитов («%» — содержание ретикулоцитов от общего числа эритроцитов). Данный показатель отражает возможность выхода ретикулоцитов в периферическую кровь и их дальне​йшее превращение в зрелые эритроциты (созревание), как вариант нормы, уже в периферической крови (в течение нескольких часов).

При нормальном эритропоэзе большинство эритроцитов проходит стадию ретикулоцитов в костном мозге [3].

Некоторые авторы отмечают, что у женщин количество ретикулоцитов несколько большее, чем у мужчин. У детей в первые дни жизни количество ретикулоцитов по разным данным может достигать 5 — 10%, а затем уменьшается.

Ретикулоциты важным показателем способности костного Увеличение их периферической крови –ретикулоцитоз, отмечается при гемолитических когда число их доходить до 60% и  более сильно увеличиваясь при кризах), при острых (на 3 – сутки после кровопотери ретикулоцитарный криз), полицитемии, при лечении железодефицитных анемий, через дне​й (3 — после начала антианемического пернициозной анемии, при недостатке кислорода. Наличие количества ретикулоцитов позволяет заподозрить кровотечение (например, больных брюшным язвенной болезнью) [5].

что увеличение ретикулоцитов в периферической крови выражением хорошей регенерации в том случае, одновременно имеется  ретикулоцитоз  и в костном что называют истинным  ретикулоцитозом Отсутствие же повышенного ретикулоцитов в мозге при повышении количества в периферической говорит об усилении ретикулоцитов костного мозга периферическую кровь (ложный  ретикулоцитоз).

Ретикулоцитоз без соответствующей эритронормобластической реакции мозга, наблюдается раздражении отдельных его раковыми или воспалительными очагами.

  • гемолитических анемиях ретикулоцитов может доходить 60% и более сильно увеличиваясь при кризах);
  • острых кровопотерях 3 – сутки после возникает ретикулоцитарный криз), в числе, увеличение ретикулоцитов позволяет скрытое кровотечение у больных болезнью желудочно-кишечного брюшным тифом);
  • малярии;

при полицитемии;

  • при железом железодефицитных анемий несколько дне​й (3 10) после начала лечения пернициозной анемии);
  • остром недостатке кислорода;

при метастазах в костный мозг.

помнить, что случае усиленного эритроцитов доля ретикулоцитов может 50% вследствие завышения числа ретикулоцитов (как было отмечено ранее, ретикулоцитов рассчитывается в % от эритроцитов).

В случаях ля тяжести анемий «ретикулярный индекс», рассчитывают по (% ретикулоцитов х / 45 х где 45 – гематокрит, 1,85- количество необходимых для поступления ретикулоцитов кровь.

Если < 2 говорит о гипопролиферативном компоненте анемии, > 2-3, то увеличение образования эритроцитов [1].

приводящим к значения %- содержания ретикулоцитов могут быть следующих препаратов: противомалярийные средства, жаропонижающие фуразолидона маленьких детей), леводопы.

Запомните: ретикулоцитоз, без эритронормобластической костного мозга, при раздражении участков его метастазами или очагами.

Возможной ошибкой подсчете ретикулоцитов может быть ложное завышение наличия:

  • включений эритроцитах (тельца Жолли, малярийные
  • лейкоцитоза;
  • аномальной гемоглобина;
  • гипертромбоцитоза;
  • гигантских тромбоцитов.

Ретикулоцитопения снижение или отсутствие ретикулоцитов (ретикулоцитопения)

Снижение количества отсутствие ретикулоцитов (ретикулоцитопения) наблюдается:

  • арегенераторных апластических и анемиях;
  • при анемиях, недостаточностью содержания витамина B12, кислоты (микроцитарно-гипохромные мегалобластные анемии);
  • талассемии;
  • при сидеробластной анемии;
  • при метастазах в кость;
  • при болезни и терапии;
  • при цитостатиками;
  • аутоиммунных заболеваниях системы кроветворения;
  • при почек;
  • при алкоголизме;
  • при анемии Аддисона-Бирмера;

Прикрепленные файлы:

-issledovanie_retikulocitov

Ответ в течение 5 минут!Без посредников!

Rekomendaciya_k_kursovoj20161011183203

Источник: https://xn--d1aux.xn--p1ai/laboratornye-metody-issledovaniya-retikulotsitov/

Метод 1 – окраска ретикулоцитов в пробирке бриллиантовым крезиловым синим

Методы окраски ретикулоцитов

Перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски бриллиантового крезилового синего. В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 минут. Затем снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2 – окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II.

В пробирку помещают 0,05 мл раствора краски азур II и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20 – 30 минут.

Снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 3 – окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I.

В пробирку помещают 0,3 – 0,5 мл раствора краски азур I и 5 – 6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1 – 1,5 часа (ретикулоциты окрашиваются лучше при экспозиции 1,5 – 3 часа). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

В настоящее время в продаже имеются готовые красители для ретикулоцитов заводского изготовления. Окраска ретикулоцитов с их помощью производится согласно прилагаемой инструкции.

Подсчет ретикулоцитов

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. В мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

Интерпретация результатов

Для исследования были отобраны 20 образцов крови для определения уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина с «Сахарным диабетом» в анамнезе у пациентов отделения «Эндокринология” ГБУЗ «навлинскаяя ЦРБ»для дальнейшего исследования значения гемоглобина, ретикулоцитов, эритроцитов. Исследования проводились на базе клинической лаборатории.

Для точной интерпретации результатов необходимо вспомнить нормальные показатели: глюкозы- 3,3-5,5ммоль/л и гликозилированного гемоглобина от 4% до 5,9% .

Материал для исследования уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина: негемолизированная кровь.

Для исследования данных показателей кровь берут натощак. Желательно сдавать кровь до 10 – 10.30.часов утра. За день до сдачи анализа по возможности исключить тренировки и стрессы, за полчаса до забора крови желательно находится в спокойном состоянии.

На основании результатов исследования20 образцовкрови была выявлена группа образцов с повышенным содержанием глюкозыгликозилированного гемоглобина. Результаты исследования представлены в таблице 2.1.

Таблица 2. 1. – Показатели уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина у группы исследуемых пациентов.

№ образца крови Уровень глюкозы в крови, ммоль/л Уровень гликозилированного гемоглобина, %
1 3,6 5,4
2 6,2 6,8
3 6,0 7,9
4 5,2 3,7
5 3,4 5,1
6 4,8 6,7
7 4,7 4,6
8 3,8 5,3
9 5,6 6,8
10 6,5 6,6
11 5,3 5,5
       12 3,2 7,1
13 5,8 6,7
14 5,3, 6,0
15 5,8 6,9
16 4,4 5,6
17 3,2 4,6
18 6,6 7,8
19 4,9 4,4
20 3,3 4,5

Анализируя полученные результаты таблицы 2.1 в ходе исследования образцов крови с нормальным уровнем глюкозы для определения значений гликозилированного гемоглобина можно заметить следующее:

1) У 1,2,3,5,6,7,8,11,14,16,17,18,20 образцов крови уровень глюкозы и уровень гликозилированного гемоглобина, находятся в диапазоненормальных величин.

2) У образцов 2 , 3 ,9, 10,12,13,15,18нормальный показатель глюкозы, но уровень гликозилированного гемоглобина находится выше нормы. Можно предположить, что на следствие изменения гликозилированного гемоглобина повлияла, длительная гипергликемия.

В определении уровня гемоглобина, уровня эритроцитов и процентный уровень ретикулоцитов в крови с повышенным содержанием глюкозы были исследованы 8 образцов крови.

Таблица 2.2. Определение уровня эритроцитов, гемоглобина и ретикулоцитов в образцах с повышенным содержанием глюкозы.

Номер образца крови Пол Уровень глюкозы в крови, ммоль/л Уровень гемоглобина г/л Уровень эритроцитов /л Уровень ретикулоцитов %
2 ж 6,2   158 5,1 1,3
3 м 6,0 171 4,7 1,4
9 м 5,6 113 5,8 1,6
10 ж 6,5 117 0,1 20,8
12 ж 3,2 161 4,2 20,6
13 м 5,8 156 4,5 4,6
15 ж 5,8 154 6,1 1,4
18 м 6,6 135 6,5 1,3

Анализируя полученные результаты были выделены 3 группы:

1)  у 2,13,18 исследуемых анализов крови уровень гемоглобина в норме, уровень эритроцитов в норме, уровень ретикулоцитов в норме.

2)  у 3 и 12 уровень гемоглобина повышен, уровень эритроцитов повышен, уровень ретикулоцитов повышен, можно предположить что повышение глюкозы не носит постоянный характер и системы гемопоэза компенсирует недостаток гемоглобина и эритроцитов возникший вследствие повышения гликозированного гемоглобина.

3) у 9,10,15 уровень гемоглобина повышен, уровень эритроцитов понижен, уровень ретикулоцитов повышен. Можно предположить, что уровень глюкозы повышается довольно часто и некомпенсированн медикаментозно в следствие этого возникают признаки анемии, а именно снижение гемоглобина и повышение эритроцитов и ретикулоцитов. 

Наглядно выводы, сформулированные при анализе результатов исследования проб крови у пациентов с повышенным уровнем глюкозы можно рассмотреть на диаграмме 2.1.

Диаграмма 2.1.- Зависимость уровня глюкозы и  количества ретикулоцитов

Рассмотрев данную диаграмму 2.1 можно заметить, что уровень глюкозы повышается в следствии углеводного обмена. Показателем длительности некомпенсированного сахарного диабета является высокий уровень гликозилированного гемоглобина.

При не частых повышениях данных показателей крови система гемопоэза восполняет необходимое для протекания физиологических процессов количество эритроцитов, наполненных гемоглобином – белком переносчиком кислорода к тканям и органам.

Исходя из выше сказанного при стойком повышении в крови глюкозы и гликозилорованного гемоглобина происходит повышение ретикулоцитов как предшественников эритроцитов.

Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 467;

Источник: https://studopedia.net/10_21050_metod---okraska-retikulotsitov-v-probirke-brilliantovim-krezilovim-sinim.html

Методы подсчета количества ретикулоцитов

Методы окраски ретикулоцитов

1. Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями.

Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте + раствор азура I + раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

2. Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминисцентной микроскопии.

Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминисцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминисцентного микроскопа и специальных красителей, всвязи с чем доступен лишь немногим лабораториям.

Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминисцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым.

Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесители в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски. Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла.

Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается.

3. Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора.

В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H.Wallace и Joseph R. Culter в 1947 году.

Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода.

Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов.

Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются.

https://www.youtube.com/watch?v=NIRCkWaysjE

Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов – относительное (процентное) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемое с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод), стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex-XT-200i) дополнительные инфармативыне ретикулоцитарные параметры:

1. Ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией).

2. Ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией).

3. Ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией).

4. Незрелая фракция ретикулоцитов (IFR%, Immature Reticulocyte Fraction).

Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности косного мозга.

Методика (анализатор Sysmex-XT-2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюорсцентного красителя.

Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается более 30 000 эритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%).

Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях.

Предыдущая45678910111213141516171819Следующая

Дата добавления: 2015-01-09; просмотров: 1466; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

ПОСМОТРЕТЬ ЁЩЕ:

Источник: https://helpiks.org/2-533.html

Доктор Дмитриев
Добавить комментарий